簡要描述:Puromycin 嘌呤霉素,產(chǎn)品編碼:PS610。它有兩種規(guī)格:5ML、1ML。是無菌的鹽酸鹽溶液,經(jīng)過濾除菌,可以直接用于細(xì)胞培養(yǎng)。
詳細(xì)介紹
品牌 | 其他品牌 | 供貨周期 | 一個月 |
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應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),綜合 |
Puromycin 嘌呤霉素,產(chǎn)品編碼:PS610。
Puromycin 嘌呤霉素,
Puromycin (10 mg/mL)
01/產(chǎn)品概述
Puromycin是來源于Streptomyces alboniger的一種氨基核苷類抗生素,中文名為嘌呤霉素。嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3′末端的類似物,能夠與核糖體的A位點結(jié)合并摻入到延伸的肽鏈中。嘌呤霉素同A位點結(jié)合后,不會參與隨后的任何反應(yīng),從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的提前終止并釋放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽,從而殺死革蘭氏陽性菌、各種動物和昆蟲細(xì)胞。
Puromycin常用于篩選通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、病毒感染、轉(zhuǎn)化等方法能表達(dá)pac基因(puror)的真核或原核多克隆或單克隆細(xì)胞。pac基因編碼嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶 (PAC,Puromycin N-acetyl-tranferase),賦予機體對嘌呤霉素產(chǎn)生抗性。這一特性目前普遍應(yīng)用于篩選表達(dá)pac基因的哺乳動物穩(wěn)定細(xì)胞株。嘌呤霉素在細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選中的普遍應(yīng)用與慢病毒載體的特性有關(guān),現(xiàn)在很多商業(yè)化的慢病毒載體都攜帶pac基因(一般在質(zhì)粒圖譜上標(biāo)記為puror),從而利用嘌呤霉素篩選特定基因的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。Puromycin的特點是快速作用于細(xì)胞,一般2天內(nèi)可以殺死99% 的不表達(dá)pac基因的細(xì)胞。Puromycin不僅用于穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選,也用于穩(wěn)定細(xì)胞株的維持。在某些特定情況下,嘌呤霉素也可以用來篩選轉(zhuǎn)化攜帶pac基因質(zhì)粒的大腸桿菌菌株、酵母菌株等。
本品是無菌的嘌呤霉素鹽酸鹽溶液(10 mg/mL),經(jīng)過濾除菌,可以直接用于細(xì)胞培養(yǎng)。
02/產(chǎn)品組分
03/保存條件
冰袋(wet ice)運輸。-20℃ 保存,有效期12個月。建議分裝保存,避免反復(fù)凍融。
04/產(chǎn)品特點
v 即用型試劑,無需進行試劑配置,簡單方便。
v 無菌制劑,可直接加入細(xì)胞使用。
05/實驗步驟
一、Dose-response curve or kill curve嘌呤霉素劑量反應(yīng)曲線的確定(以shRNA轉(zhuǎn)染或者慢病毒感染為例)
嘌呤霉素的有效篩選濃度跟細(xì)胞類型、生長狀態(tài)、細(xì)胞密度、細(xì)胞代謝及細(xì)胞所處細(xì)胞周期等因素相關(guān)。為了篩選到穩(wěn)定表達(dá)的shRNA或感染病毒的細(xì)胞株,確定殺死未轉(zhuǎn)染/感染細(xì)胞的最小濃度嘌呤霉素非常重要。 對于初次使用的細(xì)胞,一般需要通過實驗來確定適合自身實驗體系的劑量反應(yīng)曲線(dose-response curve or kill curve)。
1. 提前一天在24孔板中以5~8×104cells/孔的密度接種細(xì)胞,設(shè)置劑量梯度及復(fù)孔,37℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。
2. 次日,將培養(yǎng)過夜后的細(xì)胞更換含不同濃度嘌呤霉素的篩選培養(yǎng)基(新鮮配置),
如0、1、2.5、5、7.5、10、15、20 μg/mL等濃度梯度,設(shè)置至少5個濃度梯度,37℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
3. 由于嘌呤霉素可以快速作用于細(xì)胞,一般2天內(nèi)可以殺死99% 的未表達(dá)pac基因的細(xì)胞,所以在添加嘌呤霉素后的1-2天就可以觀察細(xì)胞存活率,從而確定有效殺死正常細(xì)胞的藥物最小濃度。如果細(xì)胞耐藥性比較強,需要每日監(jiān)測細(xì)胞,觀察存活細(xì)胞率,約 2-3 天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基,一般4-10天內(nèi)即可確定嘌呤霉素的最小濃度。
二、建議使用濃度
哺乳動物細(xì)胞:1-10 μg/mL,最佳濃度需根據(jù)嘌呤霉素劑量反應(yīng)曲線來確定。
大腸桿菌:LB瓊脂培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化pac基因的大腸桿菌,使用濃度為125 μg/mL。
? 使用嘌呤霉素篩選大腸桿菌穩(wěn)轉(zhuǎn)株需要精確的pH值調(diào)節(jié),并受宿主細(xì)胞本身的影響。
三、哺乳動物穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選
轉(zhuǎn)染含有pac基因的質(zhì)?;蛘吒腥竞性摶虻牟《竞螅纯墒褂绵堰拭顾睾Y選穩(wěn)定表達(dá)株。
1. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染或感染48小時后,將細(xì)胞置于含有適當(dāng)濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng),此為處理組。
? 當(dāng)細(xì)胞處于分裂活躍期時,抗生素作用明顯。細(xì)胞過于密集,抗生素產(chǎn)生的效力會明顯下降,所以細(xì)胞的密度最好不超過35%。轉(zhuǎn)染或感染48小時后,如果細(xì)胞過密也可以消化后重新接種細(xì)胞,培養(yǎng)過夜后即可進行嘌呤霉素篩選。
? 建議同時做一個空白正常細(xì)胞的對照組。
2. 每隔2-3天,更換含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基。
3. 篩選2-10天后,對照組正常細(xì)胞應(yīng)該100% 死亡,處理組中存活的細(xì)胞為表達(dá)pac基因的細(xì)胞。然后根據(jù)實驗?zāi)康倪M行多克隆或單克隆細(xì)胞的篩選。
? 應(yīng)每日進行細(xì)胞生長狀態(tài)的觀察。嘌呤霉素的篩選至少需要24小時,有效濃度嘌呤霉素的篩選周期一般在2-10天。
4. 待細(xì)胞可以穩(wěn)定生長后,嘌呤霉素的濃度可以減半用于后續(xù)的培養(yǎng)。在得到穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株后,一般建議嘌呤霉素也須持續(xù)加入,并2-3天更換含有嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)液。
06/適用范圍
Puromycin普遍應(yīng)用于穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選和維持,也可以用來篩選轉(zhuǎn)化攜帶pac基因質(zhì)粒的大腸桿菌菌株、酵母菌株等。
07/注意事項
1. 為了您的健康安全,請規(guī)范操作,穿戴實驗服與手套開展實驗。
2. 本產(chǎn)品對人體有害,操作時請小心,并注意有效防護以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。
3. 本產(chǎn)品僅供科研使用,請勿用于臨床診斷及治療。
08/實驗案例分析
1. 提前一天使用10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line(CL110001),待細(xì)胞密度為75% 左右開始包裝慢病毒。
2. 使用ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit(LP110-10)進行慢病毒包裝,具體步驟參考LP110-10產(chǎn)品說明書。
3. 收集慢病毒上清液,300xg離心10分鐘以除去細(xì)胞碎片,0.22 μm濾器過濾,使用ViralStars LC Lentivirus Concentration Solution慢病毒濃縮試劑盒(LC110R)進行20倍濃縮,使用1 mL ViralStars LS Lentivirus Storage Solution(LS110R)重懸慢病毒顆粒。
4. 提前一天在24孔板中鋪Hela細(xì)胞,使用上述制備的慢病毒感染目的細(xì)胞HeLa。在EP管中做病毒10倍梯度稀釋,連續(xù)6個稀釋梯度。稀釋方法如下:準(zhǔn)備6個?菌EP管,每個EP管中加?450μL 新鮮的*培養(yǎng)基(含10 μg/mL polybrene),取待測定病毒液50 μL加?到第?個EP管中(標(biāo)記50 μL),混勻后取50 μL病毒稀釋液加?到第?個EP管中(標(biāo)記5 μL),以此類推,直到稀釋到最后?管。棄去24孔板中原有的培養(yǎng)基,將稀釋好的病毒依次加入孔中,并做好標(biāo)記,??操作,不要吹起細(xì)胞,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。
5. 慢病毒感染16 h后,吸去帶病毒的培養(yǎng)基,在每個孔中再加入?500 μL?預(yù)熱的新鮮*培養(yǎng)基。
6. 使用含puromycin(5 μg/mL)的篩選培養(yǎng)基進行篩選,對篩選7天后的細(xì)胞進行結(jié)晶紫染色,并拍照記錄,實驗結(jié)果如圖2所示。
09/其他相關(guān)產(chǎn)品
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