簡要描述:realtimeprimers qPCR 預(yù)混液用于實(shí)時(shí) PCR 的 AzuraQuant™ Green 和 Probe Fast qPCR 主混合物 實(shí)時(shí)
詳細(xì)介紹
品牌 | 其他品牌 | 供貨周期 | 一個(gè)月 |
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應(yīng)用領(lǐng)域 | 環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),制藥,綜合 |
AzuraQuant™ Probe Fast qPCR Mix 是一種即用型 2x 主混合物,用于實(shí)時(shí)定量 PCR 測(cè)定,專為探針檢測(cè)技術(shù)而配制,包括 TaqMan®、Scorpions® 和分子信標(biāo)探針。
AzuraQuant™ Green Fast qPCR Mix Fluor |
AzuraQuant™ Green Fast qPCR Mix LoRox |
AzuraQuant™ Green Fast qPCR Mix HiRox |
AzuraQuant™ Probe Fast qPCR Mix - No Rox |
AzuraQuant™ Probe Fast qPCR Mix LoRox |
AzuraQuant™ Probe Fast qPCR Mix HiRox |
AzuraQuant Green 1-Step qRT-PCR Kit Fluor LoRox |
AzuraQuant Green 1-Step qRT-PCR Kit Fluor HiRox |
概述 - 定量“實(shí)時(shí)"PCR 或 qPCR
定量實(shí)時(shí) PCR 改變了我們測(cè)量核酸濃度的能力,并且是驗(yàn)證微陣列分析和其他基因組技術(shù)生成的表達(dá)數(shù)據(jù)的重要一步。實(shí)時(shí) qPCR 儀器的開發(fā)促進(jìn)了這一點(diǎn),該儀器可測(cè)量反應(yīng)每個(gè)步驟或“實(shí)時(shí)"產(chǎn)生的 qPCR 產(chǎn)物的量。 SYBR green 因其相對(duì)簡單和可靠而成為目前流行的實(shí)時(shí) PCR 方法。在實(shí)時(shí) PCR 技術(shù)發(fā)展之前,定量測(cè)量需要設(shè)置多個(gè) PCR 反應(yīng),以便在擴(kuò)增的線性階段捕獲 qPCR 產(chǎn)物。然后通過凝膠電泳或 HPLC 進(jìn)行 PCR 產(chǎn)物的分離和定量。這些實(shí)驗(yàn)非常費(fèi)力,并且實(shí)現(xiàn)正確定量所需的操作次數(shù)增加了引入錯(cuò)誤的可能性。因此,能夠在每個(gè)熱循環(huán)測(cè)量 PCR 產(chǎn)物的實(shí)時(shí) PCR 儀器的開發(fā)提高了定量 PCR 的簡便性、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。由于實(shí)時(shí) PCR 的發(fā)現(xiàn),出現(xiàn)了多種應(yīng)用。其中包括 1) 通過微陣列分析或下一代測(cè)序 (NGS) 獲得的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的驗(yàn)證,2) DNA 拷貝數(shù)的測(cè)量,3) 病毒顆粒和潛在致命微生物的檢測(cè)和定量,4) 突變/SNP 分析,以及5)miRNA表達(dá)。實(shí)時(shí) PCR 儀器的開發(fā)可以在每個(gè)熱循環(huán)中測(cè)量 PCR 產(chǎn)物,從而提高了定量 PCR 的簡便性、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。由于實(shí)時(shí) PCR 的發(fā)現(xiàn),出現(xiàn)了多種應(yīng)用。其中包括 1) 通過微陣列分析或下一代測(cè)序 (NGS) 獲得的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的驗(yàn)證,2) DNA 拷貝數(shù)的測(cè)量,3) 病毒顆粒和潛在致命微生物的檢測(cè)和定量,4) 突變/SNP 分析,以及5)miRNA表達(dá)。實(shí)時(shí) PCR 儀器的開發(fā)可以在每個(gè)熱循環(huán)中測(cè)量 PCR 產(chǎn)物,從而提高了定量 PCR 的簡便性、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。由于實(shí)時(shí) PCR 的發(fā)現(xiàn),出現(xiàn)了多種應(yīng)用。其中包括 1) 通過微陣列分析或下一代測(cè)序 (NGS) 獲得的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的驗(yàn)證,2) DNA 拷貝數(shù)的測(cè)量,3) 病毒顆粒和潛在致命微生物的檢測(cè)和定量,4) 突變/SNP 分析,以及5)miRNA表達(dá)。其中包括 1) 通過微陣列分析或下一代測(cè)序 (NGS) 獲得的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的驗(yàn)證,2) DNA 拷貝數(shù)的測(cè)量,3) 病毒顆粒和潛在致命微生物的檢測(cè)和定量,4) 突變/SNP 分析,以及5)miRNA表達(dá)。其中包括 1) 通過微陣列分析或下一代測(cè)序 (NGS) 獲得的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的驗(yàn)證,2) DNA 拷貝數(shù)的測(cè)量,3) 病毒顆粒和潛在致命微生物的檢測(cè)和定量,4) 突變/SNP 分析,以及5)miRNA表達(dá)。
一般來說,實(shí)時(shí) PCR 方案與標(biāo)準(zhǔn) PCR 反應(yīng)類似。同樣的問題也適用于生產(chǎn)干凈的模板、設(shè)計(jì)引物和優(yōu)化反應(yīng)條件。主要區(qū)別在于加入了 SYBR green 等嵌入劑或使用熒光引物來檢測(cè) PCR 產(chǎn)物。在典型的反應(yīng)中,qPCR 產(chǎn)物的產(chǎn)生呈指數(shù)級(jí)增長。由于需要幾個(gè)循環(huán)才能輕松檢測(cè)到足夠的產(chǎn)物,因此熒光與循環(huán)數(shù)的圖呈現(xiàn) S 形外觀。在稍后的循環(huán)中,反應(yīng)底物耗盡,qPCR 產(chǎn)物不再加倍,并且曲線開始變平。曲線上熒光量開始快速增加的點(diǎn),通常比基線高幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差,稱為閾值循環(huán)(Ct 值)。 Ct 與模板的關(guān)系圖是線性的,因此比較多個(gè)反應(yīng)之間的 Ct 值可以計(jì)算出目標(biāo)核酸的濃度。這條線的斜率提供了 qPCR 效率的衡量標(biāo)準(zhǔn)。
PCR產(chǎn)物可通過生成標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量或相對(duì)于對(duì)照基因進(jìn)行定量?;跇?biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)PCR定量可以利用質(zhì)粒DNA或其他形式的DNA,其中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的絕對(duì)濃度是已知的。然而,必須確保標(biāo)準(zhǔn)品的 PCR 效率與“未知"樣品的 PCR 效率相同。在某些情況下,從純化的靶標(biāo)中進(jìn)行 PCR 比用復(fù)雜的核酸混合物觀察到的效率更高。相對(duì)定量方法稍微簡單一些,因?yàn)樗枰獪y(cè)量管家或?qū)φ栈蛞允鼓繕?biāo)基因的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化。然而,選擇適當(dāng)?shù)目刂苹蚩赡軙?huì)引起問題,因?yàn)樗鼈儾灰欢ㄔ谒形粗獦颖局芯缺磉_(dá)。這可以通過對(duì)一組管家基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)量來避免,以避免這種變異性問題。
進(jìn)行實(shí)時(shí) PCR 的一個(gè)關(guān)鍵方面是從高純度的模板開始。在處理某些生物樣品時(shí),這可能具有挑戰(zhàn)性。幸運(yùn)的是,已經(jīng)開發(fā)了許多商業(yè)產(chǎn)品來促進(jìn)高純度核酸的分離。去除污染性苯酚和不需要的 DNA 是需要考慮的步驟。對(duì)于基因表達(dá)研究,必須使用高純度試劑并多次重復(fù)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,因?yàn)榇瞬襟E可能會(huì)引入模板復(fù)制的變異性。逆轉(zhuǎn)錄可以在實(shí)時(shí)PCR之前進(jìn)行,或者可以并入擴(kuò)增程序中。
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