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ViralStars 慢病毒包裝試劑盒

簡(jiǎn)要描述:ViralStars 慢病毒包裝試劑盒,產(chǎn)品編碼:LP110。
它有三種規(guī)格:10T/kit、20T/kit、40T/kit。

  • 產(chǎn)品型號(hào):LP110
  • 廠商性質(zhì):代理商
  • 更新時(shí)間:2024-11-12
  • 訪  問  量:528

詳細(xì)介紹

品牌其他品牌貨號(hào)LP110
供貨周期現(xiàn)貨應(yīng)用領(lǐng)域醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),綜合


ViralStars 慢病毒包裝試劑盒,產(chǎn)品編碼:LP110。

ViralStars 慢病毒包裝試劑盒


ViralStarsTM LP

Lentivirus Packaging Kit

Catalog Number:LP110



01/產(chǎn)品概述


慢病毒是一種有包膜的RNA病毒,直徑為80-120 nm,呈二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)、球形。病毒顆粒最外層是包膜(包膜蛋白決定了感染細(xì)胞的類型),再往里依次為基質(zhì)蛋白和衣殼,最里面是兩條相同的正股RNA鏈和酶(逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和蛋白酶)。


慢病毒表達(dá)載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質(zhì)粒可提供包裝重組慢病毒載體所需的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒,需要利用表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時(shí)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,在細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝,包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中,離心取得上清液后,可以直接或濃縮后用于宿主細(xì)胞的感染。


慢病毒感染細(xì)胞的第一步是通過包膜蛋白與細(xì)胞表面受體結(jié)合。慢病毒與宿主細(xì)胞膜融合后釋放結(jié)構(gòu)蛋白、酶蛋白和病毒核心。病毒RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下逆轉(zhuǎn)錄并與整合酶形成整合前復(fù)合物。整合前復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核后,整合酶催化其整合至宿主基因組。整合后的DNA轉(zhuǎn)錄為mRNA,回到細(xì)胞漿中,表達(dá)目的蛋白或產(chǎn)生RNAi干擾。


ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit慢病毒包裝試劑盒屬于第二代慢病毒包裝體系,同時(shí)可兼容第二代和第三代慢病毒包裝質(zhì)粒。慢病毒中的毒性基因已經(jīng)被剔除并被外源性目的基因所取代,屬于假型病毒,即產(chǎn)生的慢病毒感染目的細(xì)胞后不會(huì)再感染其他細(xì)胞,也不會(huì)利用宿主細(xì)胞產(chǎn)生新的病毒顆粒。ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit包裝的慢病毒具有感染效率高、感染譜廣等特點(diǎn),可實(shí)現(xiàn)外源基因在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)。經(jīng)該試劑盒包裝獲得的對(duì)照質(zhì)粒病毒滴度可達(dá)108 TU/mL。


ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit慢病毒包裝試劑盒包含如下組分:

(1) 優(yōu)化配比的慢病毒包裝輔助質(zhì)?;旌衔铮≒ackage Plasmid Mix),經(jīng)過設(shè)計(jì)調(diào)整,可兼容大多數(shù)慢病毒表達(dá)載體,確保將重組子包裝成具有高感染率的慢病毒顆粒。

(2) 表達(dá)GFP 和 Puro標(biāo)記的對(duì)照質(zhì)粒(Control Plasmid),便于觀察病毒包裝效率及測(cè)定病毒滴度。

(3) 高效轉(zhuǎn)染試劑(PolyShooter Transfection Reagent),具有更高的轉(zhuǎn)染效率和更低的細(xì)胞毒性。

(4) 常用病毒感染增強(qiáng)試劑Polybrene,能夠顯著提高病毒與細(xì)胞的接觸及感染效率。



02/產(chǎn)品組分

ViralStars 慢病毒包裝試劑盒



03/保存條件


冰袋(wet ice)運(yùn)輸。-20℃ 保存,有效期12 個(gè)月。



04/產(chǎn)品特點(diǎn)


* 簡(jiǎn)單快速——操作簡(jiǎn)單,無需對(duì)包裝輔助質(zhì)粒進(jìn)行抽提,也無需對(duì)包裝體系進(jìn)行優(yōu)化

* 病毒滴度高——可包裝出高滴度、高表達(dá)水平的慢病毒

* 應(yīng)用范圍廣——經(jīng)過設(shè)計(jì)及優(yōu)化配比,兼容大多數(shù)慢病毒表達(dá)載體



05/實(shí)驗(yàn)流程概要

ViralStars 慢病毒包裝試劑盒



06/實(shí)驗(yàn)步驟


一、重組慢病毒制備

1. 細(xì)胞準(zhǔn)備

轉(zhuǎn)染前一天,將4-6×106 個(gè)293T細(xì)胞接種到10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,使其在包裝時(shí)密度為70%-80%,放置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h~24 h。

? 細(xì)胞狀態(tài)會(huì)極大影響病毒包裝效率,待包裝細(xì)胞應(yīng)處于良好生長(zhǎng)狀態(tài),建議使用生長(zhǎng)處于指數(shù)期、存活率大于90% 的細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝。

? 該包裝系統(tǒng)與ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line(CL110001)配合使用,可包裝出更高滴度、更高表達(dá)水平的慢病毒。

2. 慢病毒包裝

(1) 取10 μL慢病毒包裝輔助質(zhì)粒混合物(Package Plasmid Mix)加入到2 mL離心管中,加入2.5 μg含有目的基因的慢病毒載體質(zhì)粒,輕輕混合,加入32 μL PolyShooter 轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)?;旌希覝胤跤?分鐘。

? 慢病毒載體質(zhì)粒需根據(jù)研究基因自行構(gòu)建,應(yīng)使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取,保證質(zhì)粒A260/A280比值為1.8-2.0,濃度不低于500 ng/μL。溶解后的質(zhì)粒切忌反復(fù)凍融,需按照使用量進(jìn)行分裝并于-20℃保存。

(2) 往上述混合物中加入1.8 mL無血清無雙抗的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基,輕輕混勻,在室溫下靜置30分鐘,形成轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。

? 轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物在室溫下4個(gè)小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定。

(3) 將上述1.8 mL轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物輕輕地逐滴均勻加入10 cm皿293T細(xì)胞中,輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿混勻,置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)產(chǎn)毒。

3. 收獲病毒

(1) 轉(zhuǎn)染24 h后,可選擇棄去初始病毒上清液,加入10-15 mL新鮮的*培養(yǎng)基(DMEM +10% FBS)至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)(此步驟可選)。

(2) 轉(zhuǎn)染48 h后,收集病毒上清液,再加入10-15 mL新鮮的*培養(yǎng)基(DMEM +10% FBS)至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

(3) 轉(zhuǎn)染72 h后,觀察細(xì)胞狀態(tài)并拍照,進(jìn)行二次病毒上清液收集,與48 h收集的上清液混合,300xg離心10分鐘以除去細(xì)胞碎片,使用0.22 μm濾器過濾,過濾后的上清液可直接感染目的細(xì)胞,或使用慢病毒濃縮試劑盒(LC110R)濃縮后感染目的細(xì)胞。

? 切忌反復(fù)凍融病毒,凍融一次病毒滴度將降低10-20%。-80℃保存的慢病毒最好在半年內(nèi)使用。


二、病毒滴度測(cè)定

1. 孔稀釋法標(biāo)定帶熒光的重組慢病毒滴度

(1) Day1:準(zhǔn)備細(xì)胞

對(duì)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293T細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后稀釋至?1-3x105個(gè)?/mL?,加入96孔板,100?μL/孔(1-3x104個(gè)?/孔),每?種慢病毒設(shè)6個(gè)梯度孔,置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(2) Day2:病毒的稀釋與感染

在EP管中做10倍梯度稀釋,連續(xù)6個(gè)稀釋梯度。稀釋方法如下:準(zhǔn)備6個(gè)?菌EP管,每個(gè)EP管中加?90μL 新鮮的*培養(yǎng)基(含10 μg/mL polybrene),取待測(cè)定病毒液10 μL加?到第?個(gè)EP管中(標(biāo)記10 μL),混勻后取10 μL病毒稀釋液加?到第?個(gè)EP管中(標(biāo)記1 μL),以此類推,直到稀釋到最后?管。棄去96孔板中原有的培養(yǎng)基,將稀釋好的病毒依次加入孔中,并做好標(biāo)記,??操作,不要吹起細(xì)胞,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。如需設(shè)置復(fù)孔,則按復(fù)孔的數(shù)量倍數(shù)增加以上用量。


ViralStars 慢病毒包裝試劑盒


(3) Day3:棄病毒,換液

吸去含病毒的培養(yǎng)基,在每個(gè)孔中再加入?100 μL?預(yù)熱的新鮮*培養(yǎng)基。

(4) Day4:熒光計(jì)數(shù)與滴度計(jì)算

方法1:末位稀釋計(jì)數(shù)法

感染36-48 h后,用熒光顯微鏡對(duì)熒光陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。數(shù)出最后兩孔的熒光細(xì)胞數(shù)(若設(shè)置了復(fù)孔,則計(jì)算復(fù)孔內(nèi)的總數(shù)之和并計(jì)算出平均數(shù)),假設(shè)為A(倒數(shù)第二孔的

熒光細(xì)胞數(shù))和B(倒數(shù)第一孔的熒光細(xì)胞數(shù))。

慢病毒滴度計(jì)算公式1:病毒滴度 (TU/mL) =(A+B×10)×1000/2/A孔病毒量(μL)

舉例1:5號(hào)管對(duì)應(yīng)的熒光陽性細(xì)胞數(shù)為10個(gè),6號(hào)管對(duì)應(yīng)的熒光陽性細(xì)胞數(shù)為2個(gè),則病毒滴度為:

滴度(TU/mL)=?(?10+2x10)x1000/2/0.001?=?1.5x107

如果需要感染?2x105個(gè)細(xì)胞,MOI=5(1個(gè)細(xì)胞對(duì)應(yīng)5個(gè)病毒顆粒),則需病毒體積為:

所需病毒體積?=?2?x105x?5/1.5x107(mL)=?0.067?mL?=?67?μL

方法2:適量熒光計(jì)數(shù)法

感染36-48 h后,用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)對(duì)熒光比例合適(10%-50%)的連續(xù)兩個(gè)梯度進(jìn)行統(tǒng)計(jì),數(shù)出兩孔的熒光細(xì)胞數(shù)(若設(shè)置了復(fù)孔,則計(jì)算復(fù)孔內(nèi)的總數(shù)之和并計(jì)算出平均數(shù)),假設(shè)為 C(較高濃度孔的熒光細(xì)胞數(shù))和D(較低濃度孔的熒光細(xì)胞數(shù))。

慢病毒滴度計(jì)算公式2:病毒滴度 (TU/mL) =(C+D×10)×1000/2/C孔病毒量(μL)

舉例2:3號(hào)管對(duì)應(yīng)的熒光陽性細(xì)胞數(shù)為10000個(gè),4號(hào)管對(duì)應(yīng)的熒光陽性細(xì)胞數(shù)為2000個(gè),則病毒滴度為:

滴度(TU/mL)=?(?10000+2000x10)x1000/2/0.1?=?1.5x108

如果需要感染?2x105個(gè)細(xì)胞,MOI=30(1個(gè)細(xì)胞對(duì)應(yīng)30個(gè)病毒顆粒),則需病毒體積為:

所需病毒體積?=?2?x105x?30/1.5x108(mL)=?0.04?mL?=?40?μL

2. 相對(duì)定量PCR標(biāo)定非熒光的重組慢病毒滴度

(1) Day1:準(zhǔn)備細(xì)胞

對(duì)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293T細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后稀釋至1-3x105個(gè)?/mL?,加入24孔板,500?μL/孔(?0.5-1.5x105個(gè)?/孔),每?種慢病毒設(shè)6個(gè)梯度孔,置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(2) Day2:病毒的稀釋與感染

在EP管中做10倍梯度稀釋,連續(xù)6個(gè)稀釋梯度。稀釋方法如下:準(zhǔn)備6個(gè)?菌EP管,每個(gè)EP管中加?450μL 新鮮的*培養(yǎng)基(含10 μg/mL polybrene),取待測(cè)定病毒液50 μL加?到第?個(gè)EP管中(標(biāo)記50 μL),混勻后取50 μL病毒稀釋液加?到第?個(gè)EP管中(標(biāo)記5 μL),以此類推,直到稀釋到最后?管。棄去24孔板中原有的培養(yǎng)基,將稀釋好的病毒依次加入孔中,并做好標(biāo)記,??操作,不要吹起細(xì)胞,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。如需設(shè)置復(fù)孔,則按復(fù)孔的數(shù)量倍數(shù)增加以上用量。

ViralStars 慢病毒包裝試劑盒

(3) Day3:棄病毒,換液

吸去含病毒的培養(yǎng)基,在每個(gè)孔中再加入?500 μL?預(yù)熱的新鮮*培養(yǎng)基。

(4) Day4:相對(duì)定量PCR與滴度計(jì)算

用PBS清洗并將細(xì)胞吹打下來,離心收集細(xì)胞,進(jìn)行基因組DNA的提取,qPCR檢測(cè)。以被測(cè)慢病毒載體梯度稀釋為標(biāo)準(zhǔn)品,慢病毒載體上的通用引物進(jìn)行qPCR以獲得病毒整合拷貝數(shù)。以Actin質(zhì)粒梯度稀釋為標(biāo)準(zhǔn)品,Actin引物進(jìn)行qPCR檢測(cè)樣品的基因組拷貝數(shù)以得到基因組拷貝數(shù)。

慢病毒滴度計(jì)算公式3:滴度(IU/mL)=(E×N×1000)/對(duì)應(yīng)孔病毒量(μL),其中E=平均每基因組慢病毒整合拷貝數(shù),N=感染時(shí)細(xì)胞的數(shù)目(約為1.5×105)。

? 測(cè)定時(shí),設(shè)置一組帶熒光的已知TU的慢病毒作為對(duì)照,以校驗(yàn)檢測(cè)出的數(shù)值。


三、慢病毒感染目的細(xì)胞

VSVG包膜蛋白對(duì)不同的細(xì)胞和組織的親嗜性有很大差異,在使用慢病毒感染目的細(xì)胞之前,需要查閱相關(guān)文獻(xiàn)或進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定目的細(xì)胞的復(fù)感染指數(shù)(MOI,multiplicity of infection)。

1. 按照上述步驟包裝慢病毒及確定慢病毒滴度,通過病毒滴度和MOI計(jì)算所需病毒量(計(jì)算公式參考06/實(shí)驗(yàn)步驟/病毒滴度測(cè)定)。

2. 實(shí)驗(yàn)前一天,將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的目的細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后稀釋至1-3×105/mL,加入12孔板,1 mL/孔。放入37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

? 懸浮細(xì)胞不需要提前一天接種,實(shí)驗(yàn)前將細(xì)胞計(jì)數(shù)接種后,直接加入病毒混合液即可。

3. 配制慢病毒+polybrene+培養(yǎng)基混合液。polybrene為常用的促感染試劑,能夠顯著提高病毒與細(xì)胞的接觸及感染效率,一般使用濃度為2-10 μg/mL,但對(duì)某些細(xì)胞(如末端分化的神經(jīng)元,DC細(xì)胞等)毒性較大,初次使用建議先做毒性測(cè)試。

4. 吸去12孔板中目的細(xì)胞的培養(yǎng)基,加入3中配制的慢病毒混合液,放入37℃,5% CO2 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

? 感染懸浮細(xì)胞或半懸浮細(xì)胞,則需采用平角離心轉(zhuǎn)染法,即將適量的病毒液加入細(xì)胞培養(yǎng)板后,封好口,放入平角離心機(jī)中,低速(200xg)離心?1 h?,然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

? 若實(shí)驗(yàn)條件有限,沒有平角離心機(jī),可用離心管代替,將細(xì)胞吸入離心管中,進(jìn)行低速離心,去掉大部分上清,加入適量的病毒液,室溫放置?15 min,然后將細(xì)胞和病毒液同時(shí)吸出轉(zhuǎn)入培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。

5. 病毒感染16 h后更換為新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

6. 病毒感染36-48 h后,熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況。

7. 若表達(dá)效果不理想,可調(diào)整MOI(例如,設(shè)置MOI梯度)再次檢測(cè)。



07/適用范圍


兼容大多數(shù)慢病毒表達(dá)載體,經(jīng)過設(shè)計(jì)及優(yōu)化配比,確保將重組子包裝成具有高感染率的慢病毒顆粒,同時(shí)防止病毒的自我復(fù)制。



08/注意事項(xiàng)


1. 該系統(tǒng)與ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line(CL110001)配合使用,可包裝出更高滴度、更高表達(dá)水平的慢病毒。

2. 在收獲粗病毒后,建議額外分裝幾支20-100 µL小體積管,和其他分裝的大體積病毒一并置于-80℃保存。待這些小體積病毒結(jié)冰后,取出來融化,再測(cè)定滴度。這一步可以模擬一次凍融帶來的活性滴度下降,這樣測(cè)得的滴度才是真正具有參考價(jià)值的。

3. 為了您的健康安全,請(qǐng)規(guī)范操作,穿戴實(shí)驗(yàn)服與手套開展實(shí)驗(yàn)。

4. 所有慢病毒操作均需在BSL2級(jí)生物安全柜中進(jìn)行。

5. 本產(chǎn)品僅供科研使用,請(qǐng)勿用于臨床診斷及治療。



09/實(shí)驗(yàn)案例分析


1. 提前一天使用10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line(CL110001),待細(xì)胞密度為75% 左右開始包裝慢病毒。

2. 使用ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit(LP110-10)進(jìn)行慢病毒包裝。取10 μL慢病毒包裝輔助質(zhì)?;旌衔铮≒ackage Plasmid Mix)加入到2 mL離心管中,加入2.5 μL表達(dá)GFP 的對(duì)照質(zhì)粒(Control Plasmid),輕輕混合,加入32 μL PolyShooter轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒混合,室溫孵育3分鐘。


3. 往上述混合物中加入1.8 mL無血清無雙抗的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基,輕輕混勻,在室溫下靜置30分鐘,形成轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。

4. 將上述1.8 mL轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物輕輕地逐滴均勻加入10 cm皿慢病毒包裝細(xì)胞中,輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿混勻,置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)產(chǎn)毒。

5. 轉(zhuǎn)染24 h后,棄去初始病毒上清液,加入10 mL新鮮的*培養(yǎng)基(DMEM +10% FBS)至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

6. 轉(zhuǎn)染48 h后,收集病毒上清液,再加入10 mL新鮮的*培養(yǎng)基(DMEM +10% FBS)至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

7. 轉(zhuǎn)染72 h后,觀察細(xì)胞狀態(tài)并拍照,進(jìn)行二次病毒上清液收集,與48 h收集的上清液混合后,300xg離心10分鐘以除去細(xì)胞碎片,0.22 μm濾器過濾,使用ViralStars LC Lentivirus Concentration Solution慢病毒濃縮試劑盒(LC110R)進(jìn)行20倍濃縮,使用1 mL ViralStars LS Lentivirus Storage Solution(LS110R)重懸慢病毒顆粒。

8. 孔稀釋法測(cè)定病毒滴度(參考06/實(shí)驗(yàn)步驟中病毒滴度測(cè)定方法),使用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況,并拍照記錄,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。



ViralStars 慢病毒包裝試劑盒



10/其他相關(guān)產(chǎn)品

ViralStars 慢病毒包裝試劑盒



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  7. 公司突出創(chuàng)新思維,提高工作效能,減低運(yùn)作成本,為客戶提供優(yōu)惠的價(jià)格。


























































































































































































































































































































































































































































































































































































































































































雙雙寬迷你垂直系統(tǒng) CE,2 位。 雙倍容量標(biāo)準(zhǔn)尺寸的雙單元,運(yùn)行相當(dāng)于 4 標(biāo)準(zhǔn)迷你凝膠。 包括 2 個(gè)您選擇的梳子,2 個(gè)玻璃板套,2 個(gè)墊片套,2 個(gè)用于鑄造的凝膠包裹墊圈。玻璃板尺寸為 20 厘米 x 10 厘米(h)。 對(duì)于迷你 SDS PAGE,迷你二維電泳。

















































































































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