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免疫組織化學(xué) (IHC) – 實(shí)驗(yàn)方案

更新時(shí)間:2023-12-21      點(diǎn)擊次數(shù):467

免疫組織化學(xué)是免疫染色在組織學(xué)中的重要應(yīng)用。它需要使用與生物組織中的這些抗原結(jié)合的抗體來(lái)特異性檢測(cè)細(xì)胞中的抗原。組織樣本通過石蠟包埋或福爾馬林固定方法固定,并用抗原修復(fù)劑進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理對(duì)于通過破壞福爾馬林誘導(dǎo)的抗原交聯(lián)來(lái)改善抗原的表達(dá)至關(guān)重要。然后封閉載玻片以減少背景,并可以通過直接標(biāo)記或間接測(cè)定進(jìn)行染色。

脫蠟

  1. 將載玻片在 60°C 孵育 60 分鐘。

  2. 在二甲苯中脫蠟 10 分鐘,然后再重復(fù)一次。

  3. 在 100% 酒精中水合 5 分鐘,然后在 95% 酒精中水合 5 分鐘,然后在 85% 酒精中水合 5 分鐘,然后在 75% 酒精中水合 5 分鐘。

  4. 浸入蒸餾水中5分鐘

  5. 浸入 TBS(50 mM Tris、100 mM NaCl、pH 7.6)中,放置 5 分鐘,然后重復(fù)兩次。

抗原修復(fù)

  1. 將 500-2000 ml 10 mM 檸檬酸鹽緩沖液 (pH6.0) 在不銹鋼高壓鍋中煮沸。

  2. 將載玻片放入染色架中,然后放入高壓鍋中,確保載玻片充分浸入檸檬酸鹽緩沖液中。

  3. 3-4 分鐘后,當(dāng)壓力指示閥上升時(shí),孵育 1 分鐘。

  4. 將載玻片自然冷卻至室溫。

  5. 浸入蒸餾水中,放置 5 分鐘,重復(fù)兩次。

  6. 將載玻片浸入 TBS 中 5 分鐘,然后重復(fù)兩次。

  7. 在室溫下將載玻片浸入 3% H2O2(新鮮甲醇中)15 分鐘。

  8. 用蒸餾水清洗兩次,每次5分鐘。

  9. 用TBS(pH 7.6)洗滌兩次,每次5分鐘。

一抗染色

  1. 用 TBS 中的 3% BSA 稀釋一抗。用稀釋的一抗覆蓋載玻片上的組織切片(每張載玻片使用 50-150 μl)。

  2. 37℃孵育30分鐘或室溫60分鐘(最佳孵育時(shí)間、孵育溫度和抗體稀釋度應(yīng)由各個(gè)實(shí)驗(yàn)室確定)。

  3. 用TBS洗滌兩次,每次5分鐘。

二抗染色

  1. 與 100-200μl 聚合物增強(qiáng)劑一起孵育 37C 孵育 30 分鐘

  2. 用TBS洗滌3次,每次5分鐘。

  3. 與 100 200μl 聚合 HRP 一起孵育,并在 37C 下孵育 30 分鐘

  4. 用TBS洗滌3次,每次5分鐘。

  5. 加入dAb溶液,孵育3-10分鐘(反應(yīng)進(jìn)度和最佳時(shí)間應(yīng)根據(jù)顯微鏡確定)。

  6. 用蒸餾水清洗2次,每次5分鐘。

  7. 如果需要,用蘇木精復(fù)染切片,用蒸餾水清洗。將玻片浸入 0.1% HCl 乙醇中 1-10 秒,用蒸餾水清洗。

  8. 95%乙醇脫水1分鐘,100%乙醇脫水2×3分鐘,二甲苯脫水2×3分鐘,蓋玻片封固劑。




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