隨著反相快速色譜法在反應混合物純化中的使用增加,出現(xiàn)了很多問題,因為許多化學家不像正相或硅膠柱色譜法那樣熟悉這項技術(shù)?;瘜W家提出的問題之一是關(guān)于 pH 調(diào)節(jié)劑(特別是酸)的使用及其純化。
在反相占主導地位的 HPLC 領(lǐng)域,通常使用酸(甲酸、乙酸等),通常濃度為 0.1%。其基本原理是,如果樣品成分在溶液中可電離,則其色譜保留和峰形可能會受到影響,并且其定量也會受到挑戰(zhàn)。
電離/可電離化合物在溶液中時在帶電狀態(tài)和中性狀態(tài)之間保持平衡。這些分子在中性溶劑系統(tǒng)中進行色譜分析時,可以顯示為前峰(想想滑雪坡),因為電離部分比中性狀態(tài)更易溶于水,因此洗脫得更快。添加 pH 調(diào)節(jié)劑,無論是酸還是堿,都可以迫使平衡全進入中性狀態(tài)或進入電離狀態(tài)。當全電離時,化合物會提前洗脫;當中性時,該化合物更具疏水性,并且其在柱上的保留增強。
例如,我們來看看通過琥珀酸酐和 α-甲基芐胺的微波反應生成的合成 N-(1-苯乙基)琥珀酰亞胺的純化,如圖 1 所示。
圖 1. 使用 Biotage® Initiator+ 微波反應器進行琥珀酸酐與 α-甲基芐胺的反應
當使用中性溶劑純化時,產(chǎn)品前沿很差,表明它處于電離態(tài)和中性態(tài)之間的平衡,圖 2。
圖 2. 使用中性水和乙腈的反應混合物反相快速色譜顯示前沿產(chǎn)物峰。
產(chǎn)品作為非高斯前沿峰洗脫的問題是,它是一個寬廣的峰,并且收集在多個柱體積 (CV) 中。這意味著收集的產(chǎn)物被稀釋在比典型或期望更多的溶劑中,這增加了蒸發(fā)餾分溶劑的體積和時間,并增加了較低純度和回收率的可能性。事實上,該反應混合物中存在較早洗脫的副產(chǎn)物,其污染了早期產(chǎn)物級分。是的,這些餾分可以被丟棄,但這會降低回收的產(chǎn)品產(chǎn)量,這不一定是理想的解決方案。
通過將酸(在本例中為0.2%冰醋酸)引入到水和乙腈中,可電離的反應混合物組分質(zhì)子化。質(zhì)子化產(chǎn)物的洗脫帶減少(銳化),從而增加了其濃度以及與污染副產(chǎn)物的分離,圖 3。副產(chǎn)物也質(zhì)子化,導致其比中性流動相更早洗脫。結(jié)果是大大改善了分離,產(chǎn)物以更集中的譜帶洗脫,并且與副產(chǎn)物的分離度更高。
圖 3. 使用酸化溶劑系統(tǒng)純化反應混合物,使產(chǎn)物峰尖銳并降低干擾副產(chǎn)物的保留。
然而,化學家在使用 pH 值修改的流動相時需要小心,因為潛在的化合物保留隨 pH 值變化而變化。在前面的例子中,電離化合物移動是有幫助的,但質(zhì)子化化合物并不總是朝著有利的方向移動。當 pH 值發(fā)生變化時,洗脫的化合物可能會相互靠近甚至共洗脫。
我們可以看到這種情況發(fā)生在由靛紅酸酐和 α-甲基芐胺微波反應生成的合成產(chǎn)物 2-氨基-N-(1-苯乙基)苯甲酰胺中,圖 4。
圖 4. 靛紅酸酐與 α-甲基芐胺的微波反應
當使用中性水/甲醇梯度純化時,我們可以看到一些極性副產(chǎn)物在產(chǎn)品之前洗脫,以及強烈保留的副產(chǎn)物在產(chǎn)品后面以 9.5 至 14 CV 之間的寬峰形式洗脫,圖 6。
圖 6. 反應混合物的 pH 中性反相快速色譜
在兩種洗脫溶劑中添加 0.2% 冰醋酸后,洗脫化合物的保留率發(fā)生顯著變化。副產(chǎn)物在中性 pH 值下以 4 CV 洗脫,在酸性條件下離子化并以 1.5 CV 洗脫。尾隨的疏水性副產(chǎn)物也電離并移近產(chǎn)物,圖 7。
圖 7. 使用酸化水/甲醇梯度純化反應混合物,改變了兩種副產(chǎn)物的保留。
隨著產(chǎn)物和尾隨副產(chǎn)物之間分辨率的降低,該反應純化的負載能力降低,這意味著需要更大的柱(和更多的溶劑)來充分純化反應產(chǎn)物。
因此,雖然流動相 pH 值調(diào)整有助于改善純化,但請注意,洗脫體積和選擇性可能會發(fā)生變化,從而可能降低純化效率。
用于創(chuàng)建此數(shù)據(jù)的設(shè)備包括:
Biotage®引發(fā)劑+微波反應器
Biotage® Selekt Single 快速色譜系統(tǒng)
Biotage® Sphere C18 色譜柱,12 克