要成功地執(zhí)行 Duolink® PLA 實驗,實驗方案中有一些必要的考慮因素需要正確地準備、設(shè)置和執(zhí)行。Duolink® PLA 產(chǎn)品可用于熒光和明場。熒光 Duolink® PLA 試劑可用于顯微鏡和流式細胞術(shù)應用。
一、實驗設(shè)計
要設(shè)計一個成功的Duolink® PLA實驗,必須考慮很多因素。這些因素包括但不限于:
1.確定蛋白質(zhì)靶標和實驗類型
2.選擇樣品(細胞或組織)
3.設(shè)計您的讀出方案
4.設(shè)計實驗對照(技術(shù)和生物)
靶標識別:
首先要確定的是目標蛋白靶標。是單一蛋白質(zhì)表達,蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用 (PPI),還是蛋白質(zhì)翻譯后修飾 (PTM)?下面簡要介紹了 Duolink® PLA 如何用于檢測各種類型的蛋白靶點。
單一蛋白表達的檢測:
檢測單個蛋白靶標有兩種方法,即使用針對靶標的一種一抗進行單一識別或兩種一抗進行雙重識別。
單一識別:
具有最高的靈敏度,建議在檢測低表達水平的單一蛋白質(zhì)靶標時使用。也可用于雙重識別實驗前對單個一抗?jié)舛鹊臏y定。但是,只有當性能良好的特異性一抗可用時,才推薦使用此方法。由于測定的敏感性,使用非特異性一抗將導致高背景。
雙重識別:
通過使用兩種一抗提供了更高的特異性。每種一抗必須針對同一靶分子上不同的、非競爭性的表位。而且,這兩種一抗必須在不同物種(小鼠、兔或山羊)中培養(yǎng),并且必須在相同的實驗條件下與靶標結(jié)合。這些條件在下面的實驗準備部分中進行了描述。
蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用檢測:
Duolink® PLA是檢測蛋白質(zhì)相互作用的方法。該方法使用兩種一抗來完成,每種抗體針對一種目標靶標,且在不同物種(小鼠、兔或山羊)中培養(yǎng)。兩種一抗必須在相同的實驗條件下與靶標結(jié)合。
蛋白質(zhì)與核酸的相互作用檢測:
蛋白質(zhì)-DNA 和蛋白質(zhì)-RNA 相互作用也可以通過使用修飾的原位雜交技術(shù)結(jié)合Duolink® PLA來進行檢測。
二、實驗準備
為確保成功執(zhí)行 Duolink® PLA 實驗,需要進行大量準備工作。這些準備工作與傳統(tǒng)的 IF、IHC 或流式細胞術(shù)所需的工作類似。本節(jié)描述了一抗鑒定、樣品制備和抗體優(yōu)化的注意事項。
一抗的選擇:
Duolink® PLA試劑是使用二抗進行靶標特異性一抗檢測的通用試劑。設(shè)置 Duolink® PLA 實驗時,一抗的選擇至關(guān)重要。
要求:
Duolink® PLA探針是驢抗小鼠、抗兔或抗山羊二抗;因此,對一抗有特定要求。這包括:
1.IgG 類
2.可以是單克隆或多克隆
3.優(yōu)選親和純化以使交叉反應性最小化
4.建議使用 IF 或 IHC 驗證
5.宿主必須是小鼠、兔子或山羊(特例情況要求使用Duolink® Probemaker)
直接偶聯(lián)一抗的使用:
有些情況下需要使用直接偶聯(lián)的一抗。Duolink® Probemaker能夠?qū)?PLA oligo (PLUS 或 MINUS) 偶聯(lián)到任何抗體上。使用 Duolink® Probemaker 的注意事項如下:
1.當一抗的宿主不是小鼠、兔或山羊時
2.當使用來自同一物種的兩種一抗時
3.當使用在與組織樣品相同的宿主中產(chǎn)生的一抗時(例如,“小鼠一抗檢測小鼠樣品")
一抗優(yōu)化:
為了成功執(zhí)行 Duolink® PLA 實驗,確定待測樣品中最佳一抗性能的條件非常重要。一抗優(yōu)化的條件應包括:
1.樣品處理(固定、透化和抗原修復)
2.一抗?jié)舛?/span>
3.阻斷溶液和抗體稀釋劑
下面介紹樣品處理、阻斷和抗體稀釋劑的具體注意事項。強烈建議首先通過 IF 或 IHC 染色鑒定一抗的條件。當使用兩種一抗時,每種一抗的優(yōu)化應分開進行,但樣品處理需要兼容兩種一抗的最佳性能。
一旦 通過IF 或 IHC 確定了條件,這些條件就可以應用于 Duolink® PLA。但是,Duolink® PLA 實驗可能需要進一步滴定一抗?jié)舛?,因為與 IF 和 IHC 相比,Duolink® PLA 具有更高的靈敏度和更放大的信號。使用上述Duolink® PLA單一識別方法可在優(yōu)化一抗?jié)舛葧r提供最高的靈敏度。這些條件可用于使用兩種一抗的 Duolink® PLA 實驗。