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什么是染料聚集Farbstoff-Aggregation?

更新時間:2023-10-17      點擊次數(shù):644

通過吸收光,染料分子進(jìn)入電子激發(fā)態(tài)。吸收的能量僅存儲很短的時間,并在激發(fā)態(tài)壽命結(jié)束后再次發(fā)射,例如作為熒光。

在染料溶液中,被激發(fā)的染料分子(被視為點偶極子或振蕩器)如果它們之間的距離足夠大,則不會相互影響。因此,整體中存在的發(fā)色團(tuán)的吸收和熒光不會改變。

發(fā)色團(tuán)之間的平均距離約為 5 - 10 nm,影響僅通過振蕩器的“輻射場"發(fā)生,即沒有直接接觸。例如,通過福斯特共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)模型描述了兩種染料分子之間的這種類型的相互作用。

如果發(fā)色團(tuán)之間的距離變得更小,例如在非常濃縮的溶液中,則由于各個振蕩器的靜電力,可能會產(chǎn)生強烈的相互影響。由于單個染料分子的分子間相互作用,這種染料溶液的吸收和熒光行為都會發(fā)生顯著變化。

羅丹明 6G 水溶液
在羅丹明6G濃水溶液的紫外/可見光譜中,在主吸收帶的短波邊緣可以觀察到肩峰的出現(xiàn)。如果通過稀釋溶液來改變濃度(c),并以同樣的方式增加比色皿的層厚度(d),那么根據(jù)朗伯-比爾定律,人們總是可以預(yù)期相同的消光,則以下過程是觀察到:等吸光點的出現(xiàn)。

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- 所有相關(guān)物質(zhì)的濃度變化是線性的,dE/dc = 0 - 表明兩種(或更多)物質(zhì)以一種確定的方式相互轉(zhuǎn)化或彼此處于平衡狀態(tài)。所以這是一個動態(tài)平衡。



解離或二聚常數(shù)可以通過實驗確定:在稀釋系列中,溶液的稀釋始終通過層厚度的變化進(jìn)行補償,可以計算“有效消光系數(shù)"。初始濃度由未發(fā)生二聚化的高度稀釋溶液的紫外光譜確定。由于各個吸收在朗伯-比爾定律中表現(xiàn)相加,因此可以使用反應(yīng)方程或質(zhì)量作用定律來制定有效消光或有效消光系數(shù)。

疏水相互作用
有機(jī)染料的聚集尤其發(fā)生在水或具有高離子強度的溶劑中。主要原因是分子間范德華力:通過所謂的“疏水相互作用",親脂性分子試圖“避開"親水性水分子,即為水化殼提供盡可能小的表面積。這種現(xiàn)象還導(dǎo)致玻璃表面上的染料吸附或與基質(zhì)分子的非特異性結(jié)合。

形成二聚體或更高聚集體的傾向取決于
 

-染料的濃度——濃度越高,聚集越強
-溶劑——與乙醇或其他有機(jī)溶劑相比,在水或甲醇中通??梢杂^察到聚集。通過比較ATTO 565在水性 PBS 緩沖液(pH 7.4)和乙醇與TFAc中的 等濃度溶液的吸收光譜,令人印象深刻地證明了這一點:

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-存在任何電解質(zhì)(鹽),特別是當(dāng)氯仿等有機(jī)溶劑中出現(xiàn)離子對時
-溫度- 在較高溫度下,熱運動使聚集更加困難
-染料的 分子結(jié)構(gòu)- 具有親水基團(tuán)的染料,如ATTO 488、ATTO 532、ATTO 542等,在水溶液中不會表現(xiàn)出任何聚集 ,與疏水性染料如ATTO Rho6G、ATTO Rho11、ATTO相比Rho12等:


由于這是動態(tài)平衡(如上所述),因此可以通過稀釋溶液將二聚體轉(zhuǎn)化回單體。當(dāng)測量的吸收光譜不再隨著進(jìn)一步稀釋和層厚度的相應(yīng)增加而變化時,達(dá)到“單體光譜"。對于大多數(shù)疏水性ATTO染料,這種情況發(fā)生在消光度約為 0.04 時(層厚 1 cm;c = 10 -7 – 10 -6 mol/l)。1697537080091.jpg


蛋白質(zhì)綴合物中的分子內(nèi)相互作用/DOL 測定
當(dāng)染料-NHS 酯與蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)時,可以形成染料綴合物,其中共價結(jié)合的染料分子非常接近并且可以彼此相互作用。這以同樣的方式通過吸收光譜的強烈變化來表達(dá),正如在 ATTO 565-steptavidin 綴合物的示例中可以清楚地看到的:在綴合物光譜中觀察到額外的短波吸收帶,

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類似于濃度足夠高的染料水溶液的“二聚體帶"。由于在這種情況下共價結(jié)合的染料分子之間存在分子內(nèi)相互作用,因此當(dāng)綴合物溶液稀釋時吸收光譜不會改變!
對于這種情況,染料-蛋白質(zhì)比率(標(biāo)記度,DOL)的確定在我們的“蛋白質(zhì)標(biāo)記"工作說明中進(jìn)行了描述。


兩種形式的聚集體之間存在基本區(qū)別:

H-聚集體(H = 低色),短波長。
當(dāng)兩個或多個染料分子以一種其躍遷偶極矩(通常在 S 0 - S 1過渡中彼此平行(沿著發(fā)色團(tuán)系統(tǒng)的縱軸運行)。觀察到向低色位移的吸收帶 - 與單體吸收相反。

由于空間接近,電子結(jié)構(gòu)相互影響,可以說,兩個分子必須一起觀察。能級被分裂,并且量子力學(xué)現(xiàn)在允許的吸收躍遷能量更高,因此波長更短。從這種較高的激發(fā)態(tài),發(fā)生快速內(nèi)部轉(zhuǎn)換(IC),從而使熒光猝滅。

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J-聚集體(根據(jù) EE Jelley 的說法),長波
這種類型的聚集會導(dǎo)致吸收帶的長波偏移,這與能帶半寬度的顯著減小有關(guān)。

J-聚集體通常存在于聚次甲基染料中,例如花青、部花青或類似的發(fā)色團(tuán)。Jelley 和 Scheibe 使用假異花青染料獨立觀察到了這一現(xiàn)象。對于由單個染料組裝形成的“超分子聚合物"的模型描述,已經(jīng)提出了各種類型。對分子關(guān)系簡單的描述是這樣的想法:各個分子一個接一個地排列,使得躍遷偶極矩也位于一條線上。分子的共同考慮導(dǎo)致能級的分裂:量子力學(xué)允許的躍遷現(xiàn)在能量較低,

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溶劑成分、鹽或其他物質(zhì)的添加以及濃度會極大地影響聚集。在理想條件下,可以在紫外/可見光譜中找到所描述的極窄吸收帶。此外,與 H 聚集體相比,這里當(dāng)然可以觀察到熒光,特別是在較低溫度下:發(fā)射帶的最大值也很窄,僅比吸收最大值長幾納米。
根據(jù)實驗條件,文獻(xiàn)還描述了吸收帶的“加寬",這可以通過包含 J 聚集體的禁電子躍遷來解釋。


ATTO 488 標(biāo)記的磷脂
溶液純氯仿中的ATTO 488標(biāo)記磷脂最初因其意想不到的顏色而令人驚訝:暗淡的溶液呈現(xiàn)粉紅色至洋紅色,而不是帶有亮綠色熒光的淺黃色。長波位移吸收可以通過 J 聚集體的存在來解釋。當(dāng)所討論的溶液用甲醇稀釋時,顏色變?yōu)橥ǔ5狞S色,并且可以看到強烈的熒光。通過改變?nèi)軇┏煞?,聚集體被推回。
下圖顯示了ATTO 488標(biāo)記的1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺 (DPPE) 在純氯仿和氯仿/甲醇(8:2,v/v)溶劑混合物中的溶液:


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