FluoroNanogold™ 探針含有熒光標(biāo)記和與靶向分子共價連接的Nanogold®簇,已成功用于相關(guān)熒光和電子顯微鏡 (EM) [1]。然而,納米金很?。?.4 nm),需要銀或金增強才能可視化[2]。與較大的膠體金制劑相比,這會產(chǎn)生更大的尺寸變異性。銀增強可能會導(dǎo)致非特異性背景;銀可以通過四氧hua鋨 (OsO 4 ) 固定進行化學(xué)蝕刻,導(dǎo)致信號丟失[2]。我們已經(jīng)制備了用于相關(guān)顯微鏡的共價連接組合熒光探針和較大的金納米顆粒探針,可以通過電鏡直接觀察,無需自動金相增強。使用自組裝涂層對直徑為 2 nm 至 40 nm 的金納米顆粒進行穩(wěn)定和功能化,該涂層包含疏水性螯合硫醇結(jié)構(gòu)域,用于將金表面與水介質(zhì)密封,以及親水性末端官能團(聚乙二醇,PEG),使金納米顆粒具有生物相容性。金納米粒子并實現(xiàn)位點特異性共價探針綴合。這提供了高穩(wěn)定性以及表面特性和共軛反應(yīng)的廣泛選擇。
5 nm 金納米顆粒的制備方法是,在增溶性非官能化硫醇和受保護的胺官能化硫醇的混合物存在下,用硼氫hua鈉直接還原金 (III) 鹽水溶液,然后使用蔗糖密度梯度 (10-30%) 進行純化超速離心(Ti-41 轉(zhuǎn)子,26,000 rpm,45 分鐘,5 ℃;距離頂部約 4 厘米的強烈紅色帶包含 5 nm 金)。通過在鹽酸甲醇中脫保護制備胺功能化的金顆粒。通過與商業(yè) N-羥基琥珀酰亞胺基-(NHS) Cy-5.5 熒光染料反應(yīng)證明了特異性反應(yīng)性。該綴合物通過 Superose-12 尺寸排阻色譜進一步純化(圖 1)。這種尺寸的不穩(wěn)定顆粒會被 0.1 M 氯化鈉沉淀,但即使在 1.0 M 氯化鈉溶液中,涂覆的顆粒仍保持分散和懸浮狀態(tài)。將它們反復(fù)離心并全重懸,不留下任何固體沉淀;對常規(guī)蛋白質(zhì)或大分子穩(wěn)定的膠體金綴合物進行相同的處理總是會導(dǎo)致部分組分損失,形成無法重懸的不溶性沉淀。
通過將 NHS 和馬來酰亞胺活化的 5 nm 金顆粒分別與二抗分子 IgG 和 F(ab') 共價連接來制備組合 5 nm 金-二抗 -Alexa Fluor 594 綴合物。然后,NHS 修飾的 Alexa Fluor 594 染料與綴合物發(fā)生反應(yīng)。使用蔗糖密度梯度超速離心純化產(chǎn)物,然后如上所述進行凝膠過濾。使用抗兔-F(ab')綴合物作為針對多克隆兔抗紅細胞抗體的二級探針來標(biāo)記懸浮液中的綿羊紅細胞,并使用 Nikon G-2A 濾光片組通過熒光顯微鏡觀察標(biāo)記情況(圖2)。抗小鼠 IgG 綴合物用作二級探針,與小鼠抗人 AE1/AE3 初級探針一起使用,在人扁桃體組織中產(chǎn)生清晰的細胞角蛋白染色(圖 3 )。熒光金綴合物的相對量子產(chǎn)率為相應(yīng)商業(yè)染料標(biāo)記二抗的 22-35%。