研究最終取決于群體的表達(dá)產(chǎn)物。無(wú)論是用于檢測(cè)還是用于棉花保護(hù),表達(dá)的蛋白都需要分離純化。但蛋白質(zhì)的性質(zhì)不同,所以方法也不同。
蛋白質(zhì)的一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)決定了其物理、化學(xué)、生化、物理、化學(xué)、生物性質(zhì)。此外,它總結(jié)了不同蛋白質(zhì)性質(zhì)的差異或改變條件使它們不同。同時(shí)利用多種性質(zhì),在兼顧產(chǎn)量和純度的情況下,選擇蛋白質(zhì)純化的方法。
蛋白質(zhì)一般以復(fù)雜混合物的形式存在于組織或細(xì)胞中,每種細(xì)胞毒性都包含數(shù)千種不同的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的分離和純化是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。蛋白質(zhì)純化的總體目標(biāo)是力圖提高產(chǎn)物的純度或比活性,要求純化合理、快速、得率高、純度高。并將蛋白質(zhì)從細(xì)胞中的其他所有成分中分離出來(lái),特別是不需要的不純蛋白質(zhì),同時(shí)仍然保留肽的生物活性和化學(xué)完整性。
之所以能從數(shù)千種蛋白質(zhì)混合物中純化出一種蛋白質(zhì),是因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)具有截然不同的物理、化學(xué)、理化和生物特性。
這些性質(zhì)是由蛋白質(zhì)的氨基酸序列和數(shù)量不同造成的,連接在多肽主鏈上的氨基酸殘基是帶正電的、帶電的、極性的還是非極性的、親水的還是疏水的。
此外,多肽還可以折疊成非常確定的二級(jí)結(jié)構(gòu)(α螺旋、β折疊和各種角度)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。利用待分離蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)性質(zhì)的差異,在蛋白質(zhì)表面形成一定大小、形狀和分布的殘基,并設(shè)計(jì)一套合理的分級(jí)分離步驟。
蛋白質(zhì)混合物可以根據(jù)蛋白質(zhì)不同性質(zhì)對(duì)應(yīng)的方法進(jìn)行分離:
不同類型的蛋白質(zhì)在分子大小上有一定的差異,可以采用一些簡(jiǎn)單的方法使蛋白質(zhì)混合物得到初步分離。
透析在純化中非常常用,可以去除鹽(脫鹽和置換緩沖液)、有機(jī)溶劑和低分子量抑制劑。透析膜的截留分子量約為5000。例如,分子量小于10000的酶溶液可能會(huì)泄漏。超濾一般用于濃縮和脫色。
許多酶富含于某種細(xì)胞器中。勻漿后,通過(guò)離心得到某種亞細(xì)胞成分,使酶富集10-20倍,然后純化出特定的酶。差速離心,分辨率低,僅適用于粗提取或濃縮。
速率分區(qū),如果離心時(shí)間太長(zhǎng),所有物質(zhì)都會(huì)沉淀。因此,需要選擇最佳的分離時(shí)間,以獲得相當(dāng)純的亞細(xì)胞成分進(jìn)行進(jìn)一步純化,避免差速離心中大、小成分的沉淀。但容量較小,只能少量使用。
密度梯度離心常用的介質(zhì)包括蔗糖、聚蔗糖、氯化銫、溴化鉀和碘化鈉。
這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物的有效方法之一。注意待分離蛋白質(zhì)的分子量在凝膠的工作范圍內(nèi)。選擇不同分子量的凝膠可用于脫鹽、更換緩沖液以及利用分子量差異去除熱源。
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在離心過(guò)程中穿過(guò)溶液時(shí),或者當(dāng)它們穿過(guò)膜、凝膠過(guò)濾填料顆粒或電泳凝膠中的小孔時(shí),蛋白質(zhì)會(huì)受到其形狀的影響。
對(duì)于相同質(zhì)量的兩種蛋白質(zhì),環(huán)狀蛋白質(zhì)的有效半徑(斯托克斯半徑)較小。通過(guò)溶液沉降時(shí)遇到的摩擦力很小,沉降速度更快,并且比其他形狀的蛋白質(zhì)顯得更大。相反,在尺寸排阻色譜中,斯托克半徑較小的球狀蛋白質(zhì)更容易擴(kuò)散到凝膠過(guò)濾填料顆粒內(nèi)部并隨后洗脫,因此它們看起來(lái)比其他形狀的蛋白質(zhì)更小。
利用蛋白質(zhì)溶解度的差異來(lái)區(qū)分各種蛋白質(zhì)的常用方法。影響蛋白質(zhì)溶解度的外界因素有很多,其中主要的有:溶液pH、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)和溫度。但在相同的特定外部條件下,不同的蛋白質(zhì)具有不同的溶解度。適當(dāng)改變外部條件來(lái)控制蛋白質(zhì)混合物中某種成分的溶解度。
蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)通常溶解度較低。
蛋白質(zhì)在不同溶劑中的溶解度差異很大,從基本不溶(<10μg/ml)到極易溶解(>300mg/ml)。影響蛋白質(zhì)溶解度的可變因素包括溫度、pH、溶劑極性、離子性質(zhì)和離子強(qiáng)度。引起蛋白質(zhì)沉淀的有機(jī)溶劑的濃度不同,因此可以控制有機(jī)溶劑的濃度來(lái)分離蛋白質(zhì)。
水溶性非離子聚合物(聚乙二醇)也會(huì)引起蛋白質(zhì)沉淀。
不同的蛋白質(zhì)在不同的溫度下具有不同的溶解度和活性。大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定,因此分離操作一般在0℃或更低的溫度下進(jìn)行。
蛋白質(zhì)的凈電荷取決于氨基酸殘基攜帶的正電荷和負(fù)電荷的總和。例如,帶有凈負(fù)電荷的中性溶液稱為酸性蛋白質(zhì)。
它不僅是分離蛋白質(zhì)混合物和鑒定蛋白質(zhì)純度的重要方法,也是研究蛋白質(zhì)性質(zhì)的非常有用的方法。
等電聚焦分辨率非常高,pI可以以0.02pH的差異分離。
蛋白質(zhì) 2D-PAGE 分離的分辨率已發(fā)展到 100,000 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。
改變蛋白質(zhì)混合溶液中的鹽離子強(qiáng)度pH和(陰離子、陽(yáng)離子)離子交換填料,不同蛋白質(zhì)對(duì)不同離子交換填料的吸附能力不同,蛋白質(zhì)因吸附能力不同或不被吸附而分離。
可以通過(guò)保持洗脫液組成恒定或通過(guò)改變洗脫液的鹽度或pH來(lái)進(jìn)行洗脫。后者又可分為分段洗脫和梯度洗脫。梯度洗脫一般效果好,分辨率高,特別是使用交換容量小、對(duì)鹽濃度敏感的離子交換劑??刂葡疵撘旱捏w積(與柱床的體積相比)、鹽濃度和pH,以及樣品組分可以從離子交換柱中單獨(dú)洗脫。
蛋白質(zhì)分子外表面暴露的側(cè)鏈基團(tuán)的類型和數(shù)量不同,因此緩沖液在一定pH值和離子強(qiáng)度下的電荷也不同。
帶電的氨基酸殘基可以均勻分布在蛋白質(zhì)表面,可以與適當(dāng)強(qiáng)度的陽(yáng)離子交換柱或與陰離子結(jié)合。由于大多數(shù)蛋白質(zhì)不能在單一溶劑中與兩種類型的離子交換柱結(jié)合,因此可以利用這種特性來(lái)純化它們。帶電的氨基酸殘基還可以成簇分布,使得一個(gè)區(qū)域帶強(qiáng)正電荷,另一區(qū)域帶強(qiáng)負(fù)電荷,呈強(qiáng)酸性或強(qiáng)酸性。可與陽(yáng)離子交換樹(shù)脂或一定pH條件下的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂結(jié)合使用。例如,鈣調(diào)蛋白只能在 pH 2 時(shí)與陽(yáng)離子交換樹(shù)脂結(jié)合。
大多數(shù)疏水性氨基酸殘基隱藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部,但也有一些位于表面。蛋白質(zhì)表面疏水性氨基酸殘基的數(shù)量和空間分布決定了蛋白質(zhì)是否具有與疏水性柱填料結(jié)合用于分離的能力。
其價(jià)格低廉,純化的蛋白質(zhì)具有生物活性,是分離純化蛋白質(zhì)的通用工具。
高濃度鹽水溶液中的蛋白質(zhì)保留在柱上,并在低鹽或水溶液中從柱上洗脫。因此,特別適合濃硫酸銨溶液沉淀分離后的母液,以及沉淀后含有目標(biāo)產(chǎn)物的溶液用鹽溶解后直接注入柱中。
7mol/鹽酸胍或8mol/L尿素也適用于直接注入柱中的大腸桿菌蛋白提取物的處理,并且在復(fù)性的同時(shí)進(jìn)行分離。
大多數(shù)蛋白質(zhì)的密度在1.3~1.4g/cm3之間。該特性通常不常用于蛋白質(zhì)分級(jí)分離。
但含有大量磷酸鹽或脂質(zhì)的蛋白質(zhì)的密度與普通蛋白質(zhì)明顯不同,因此大多數(shù)蛋白質(zhì)可以通過(guò)密度梯度離心分離。
通過(guò)改變cDNA,在表達(dá)蛋白的氨基端或羧基端添加少量額外的氨基酸,可以作為純化的有效基礎(chǔ)。
待表達(dá)的蛋白與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶一起表達(dá),然后用谷胱甘肽Sepharose 4B純化,然后用凝血酶或因子X(jué)a切割。
將待表達(dá)的蛋白與蛋白 A 的 IgG 結(jié)合位點(diǎn)融合在一起進(jìn)行表達(dá),并用 IgG Sepharose 進(jìn)行純化。
最常見(jiàn)的標(biāo)記之一是在蛋白質(zhì)的氨基末端添加6~10個(gè)組氨酸。在正常或變性條件下(8M尿素),借助其與Ni2+螯合柱緊密結(jié)合的能力,用咪唑洗滌去除或?qū)H降至5.9,使組氨酸全質(zhì)子化,不再與Ni2+結(jié)合,使其純化。
重組蛋白在設(shè)計(jì)和構(gòu)建時(shí)已融入純化概念。樣品中大多混有破碎細(xì)胞或可溶產(chǎn)物。膨脹床吸附技術(shù) STREAmLINE 適用于粗分離。
兼具效率高、分離速度快的特點(diǎn)。配體可以是酶底物、抑制劑、輔因子和特異性抗體。
吸附后,可以改變緩沖液的離子強(qiáng)度和pH值來(lái)洗脫目標(biāo)蛋白。也可用更高濃度的相同配體溶液或親和力更強(qiáng)的配體溶液進(jìn)行洗脫。
與超濾相結(jié)合,濃縮兩者的優(yōu)點(diǎn),形成超濾親和純化,具有分離效率高、可大規(guī)模工業(yè)化的優(yōu)點(diǎn),適合初步分離。
根據(jù)配體的不同,可分為:
(1)金屬螯合介質(zhì)
過(guò)渡金屬離子Cu2+、Zn2+、Ni 2+ 以亞胺配合物的形式結(jié)合。由于這些金屬離子與色氨酸、組氨酸和半胱氨酸形成配位鍵,從而形成亞胺金屬-蛋白質(zhì)螯合物,使得含有這些氨基酸的蛋白質(zhì)被該金屬螯合物親和色譜的固定相吸附。螯合物的穩(wěn)定性由單個(gè)組氨酸和半胱氨酸的解離常數(shù)控制,該解離常數(shù)還受到流動(dòng)相的 pH 和溫度的影響??刂茥l件可以將不同的蛋白質(zhì)彼此分離。
(2) 小配體親和介質(zhì)
配體包括精氨酸、苯甲酰胺、鈣調(diào)蛋白、明膠、肝素和賴氨酸。
(3) 抗體親和介質(zhì)
免疫親和層析,配體為重組蛋白A和重組蛋白G,但蛋白A比蛋白G特異性更強(qiáng),并且蛋白G可以結(jié)合更多不同來(lái)源的IgG。
(4)顏料親和介質(zhì)
染料色譜的效果主要取決于染料配體及其與酶的親和力大小。它還與洗脫緩沖液的類型、離子強(qiáng)度、pH值和待分離樣品的純度有關(guān)。有兩種配體:Cibacron Blue 和 Procion Red。在某些條件下,固定化染料可以充當(dāng)陽(yáng)離子交換劑。為了避免這種現(xiàn)象,最好在離子強(qiáng)度小于0.1、pH大于7時(shí)進(jìn)行操作。
(5) 外源凝集素親和介質(zhì)
配體包括刀豆球蛋白、扁豆凝集素和麥芽凝集素。固相凝集素可以與多種碳水化合物殘基發(fā)生可逆反應(yīng),適用于多糖和糖蛋白的純化。
流動(dòng)相中的置換劑是極性比水小的有機(jī)溶劑,這些有機(jī)溶劑可能會(huì)導(dǎo)致許多蛋白質(zhì)分子發(fā)生不可逆的變性。流動(dòng)相中必須存在離子對(duì)試劑才能使分離有效并獲得高質(zhì)量回收率。分離必須在酸性介質(zhì)中進(jìn)行,而有些蛋白質(zhì)在后兩種條件下會(huì)產(chǎn)生不可逆的分子構(gòu)象變化,因此人類在生物大分子中的分離純化受到限制。
正相色譜法在生物大分子的分離純化中應(yīng)用相對(duì)較少,因?yàn)樗玫娜軇┓浅0嘿F。
在一定的溶液條件下,有些酶可以聚合成二聚體、四聚體等,而在另一種條件下,則形成單體。
大多數(shù)蛋白質(zhì)在加熱至 95°C 時(shí)會(huì)解折疊或沉淀。利用這種特性,在加熱后保留其可溶性活性的蛋白質(zhì)可以很容易地與大多數(shù)其他細(xì)胞蛋白質(zhì)分離。
用蛋白酶處理上清液以消化受污染的蛋白質(zhì),留下對(duì)蛋白水解具有抗性的蛋白質(zhì)。
采用水相兩相萃取分離,常用的生物材料分離系統(tǒng)有:聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(DEXTRAN)、PEG/磷酸鹽、PEG/硫酸銨等。由于其含水比高,所選用的生物材料分離系統(tǒng)有:聚合物和鹽對(duì)酶無(wú)毒。而分離設(shè)備也應(yīng)用于化工行業(yè),在工業(yè)上受到重視。
開(kāi)發(fā):新型雙水相分離技術(shù)有親和雙水相萃取、膜分離雙水相萃取等。
蛋白質(zhì)溶液具有表面活性,溶液中產(chǎn)生氣體,氣泡與液相主體分離并富集在塔頂,達(dá)到分離濃縮的目的。
反膠束相轉(zhuǎn)移法是80年代出現(xiàn)的一種新型分離技術(shù)。它利用表面活性劑分子在有機(jī)溶劑中自發(fā)形成的反膠束。在一定條件下,水溶性蛋白質(zhì)分子溶解成反膠束。在極核中,創(chuàng)造條件將蛋白質(zhì)萃取到另一個(gè)水相,實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的相轉(zhuǎn)移,達(dá)到分離純化蛋白質(zhì)的目的。
反膠束中的蛋白質(zhì)分子受到周?chē)肿雍捅砻婊钚詣O性頭的保護(hù),仍然保持一定的活性,甚至表現(xiàn)出超活性。據(jù)報(bào)道,AOT/異辛烷反相膠束用于酵母脂肪酶的相轉(zhuǎn)移。