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哺乳動物細胞裂解物中 GFP 融合蛋白的免疫沉淀 (IP/CoIP) 方案

更新時間:2023-06-12      點擊次數(shù):1091

哺乳動物細胞裂解物中 GFP 融合蛋白的免疫沉淀 (IP/CoIP) 方案

該方案旨在對 GFP 標記的融合蛋白進行免疫沉淀,以通過蛋白質(zhì)免疫印跡或活性測定進行分析。
溶液和試劑
1X 細胞裂解緩沖液:50 mM Tris (pH 7.5)、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100。建議在使用前添加 1 mM PMSF。
1X 洗滌緩沖液:TBS(50 mM Tris HCl,150 mM NaCl,pH 7.5)
5X SDS 上樣緩沖液
1. 準備細胞裂解物
1. 要在非變性條件下收獲細胞,去除培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 沖洗細胞一次。去除 PBS 并向每個板(10 cm,106-107 個細胞)中加入 0.5 mL-1mL 1X 冰冷細胞裂解緩沖液(添加蛋白酶抑制劑混合物和 PMSF),并將板在冰上孵育 30-40 分鐘,4 °旋轉(zhuǎn)攝氏度。
2. 從平板上刮下裂解的細胞并轉(zhuǎn)移到微量離心管中。繼續(xù)冰上。
3. 在冰上對樣品進行超聲處理 3 次,每次 5 秒(可選步驟)。
4. 4°C、14,000 xg 微量離心 10 分鐘,將上清液轉(zhuǎn)移到新管中。如有必要,可將裂解物儲存在 –80°C 下。
注意:如果目的蛋白是核蛋白,請使用RIPA裂解液裂解細胞,并加入PIC、1mM PMSF、2.5mM Mgcl2和1mg/ml DNase I。
2. 平衡珠子
1. 顛倒產(chǎn)品管或輕輕上下吹打以重懸珠子。不要渦旋珠子。
2. 吸取 25 µL 珠漿到 EP 管(1.5 mL)中,然后加入 1 mL 冰冷的洗滌緩沖液。用手輕輕搖晃 1-2 分鐘。不要渦旋珠子。
3、磁選60秒。
4. 棄去上清,重復洗滌 3 次。
3. 免疫沉淀
1. 取 500 μL 細胞裂解液,加入 25 μL 抗體偶聯(lián)磁珠懸液,4°C 孵育 1-3 小時或 4°C 過夜。
4. 清洗蛋白質(zhì)-納米抗體-珠復合體
注意:如果研究了 Co-IP 相互作用的蛋白質(zhì),請減少洗滌次數(shù),并降低洗滌緩沖液的離子強度。
加入 1.0 mL 的 Wash Buffer 并懸浮珠子復合物,磁選,然后棄去上清液。重復上述步驟至少四次。
5. 下游分析的洗脫
GFP 融合蛋白的洗脫-根據(jù)蛋白質(zhì)特性或進一步用途推薦兩種洗脫方法:
選項 A:天然洗脫
在酸性條件下用 0.2 M 甘氨酸 (pH 2.5) 洗脫。這是一種快速有效的洗脫方法。用中和緩沖液(1 M Tris,pH 10.4)中和洗脫的蛋白質(zhì)可能有助于保持其活性。中和緩沖液需要預先放入收集管中。
注意:需提前做初步實驗,確定中和甘氨酸(PH 2.5)需要多少中和緩沖液
選項 B:SDS-PAGE 的變性洗脫
在凝膠電泳和免疫印跡的變性條件下用樣品上樣緩沖液洗脫。
A:用 0.2 M 甘氨酸 (pH 2.5) 洗脫 - 該過程應在室溫下進行。
注意:不要將珠子留在該緩沖液中超過 20 分鐘。
1. 向每個樣品和對照珠復合物中加入 50 µL 0.2 M 甘氨酸 (pH 2.5)。
2. 在 4°C 下輕輕搖動或在旋轉(zhuǎn)器上孵育樣品和對照 5-10 分鐘。
3. 將試管放入磁力分離器中以收集珠子。將上清液轉(zhuǎn)移到含有 25-35 μL 中和緩沖液的新管中。小心不要轉(zhuǎn)移任何珠子。
4. 重復步驟 1-3 以提高洗脫效率,將洗脫液集中在同一管中或通過不同管收集洗脫液。
6. 如需立即使用,請將洗脫液儲存在 2-8 °C。儲存在 –20 °C 以進行長期儲存。
B:用 SDS-PAGE 上樣緩沖液洗脫
1. 用 30 µL 1X SDS 樣品上樣緩沖液重懸每個樣品(6 µL 5X SDS 樣品上樣緩沖液可以添加到 24 µL 細胞裂解緩沖液中)。渦流。
2. 在 95 – 100°C 下將樣品管和對照管煮沸 10 分鐘。
3. 將試管放入磁力分離器中以收集珠子。將上清液轉(zhuǎn)移到新管中。樣品和對照已準備好加載到 SDS-PAGE 上,并使用抗 GFP 或針對融合蛋白的特異性抗體進行免疫印跡。



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